组织培养操作培训手册
——中国农技协四川布拖马铃薯科技小院
一、 组织培养试验原理
植物组织培养是指在无菌和人工控制条件下，利用合适的培养基，对植物的器官、组织、细胞或原生质体进行精细操作和培养，使其按照人们的意愿生长、增殖或再生的一门生物技术学科。其理论依据是植物细胞具有全能性。
二、 实验室常用仪器的构造及使用
（一）电子分析天平
1、电子分析天平的构造
电子分析天平主要由天平机体、称重舱、天平盘、键板、液晶显示等构成。
2、电子分析天平的使用
（1）调水平：天平开机前，应观察天平后部水平仪内的水泡是否位于圆环的中央，否则通过天平的地脚螺栓调节，左旋升高，右旋下降。
（2）称量：按下ON/OFF键，接通显示器；等待仪器自检。当显示器显示零时，自检过程结束，天平可进行称量；放置称量纸，按显示屏两侧的Tare键去皮，待显示器显示零时，在称量纸上加所要称量的试剂称量。称量完毕，按ON/OFF键，关断显示器。
3、注意事项
①实验室电子天平在通常情况下，不要经常切断电源。
②严禁不使用称量纸直接称量。
③称量物不能超过天平负载，不能称量热的物体。（有腐蚀性或吸湿性物体必须放在密闭容器中称量）
④清洁天平，避免对天平造成污染而影响称量精度（必要时用软毛刷或绸布抹净或用无水乙醇擦净），以及影响他人的工作
（二）纯水仪
1、纯水仪的构造
纯水仪主要由储水罐、过滤器、增压泵、输送泵等构成。
2、纯水仪的使用
（1）插上插头，按下“电源”键，此时“系统制水”指示灯亮，并开始正常工作。
（2）取水：从白色纯水储液罐内取水。
（3）光机：纯水仪使用完毕后，先按下“电源”开关，然后拔下插头
3、注意事项
①设备正常运行时请勿调整设备内的阀门。
②关机后必须等2分钟才可再开机（防止紫外灯管被烧坏）。
③严禁将重物、高温物体、有腐蚀性物品置于设备附近。
（三）全自动立式灭菌锅
1、全自动立式灭菌锅的构造
全自动立式灭菌锅主要由安全阀、容器盖、手柄、环头螺母、控制面板等构成。
2、灭菌锅的使用
（1）按下“电源”键，此时显示器的指示灯亮，并开始正常工作。
（2）向锅内加水至“高位”指示灯亮，将需要灭菌的物品放入内层锅，盖好锅盖并对称地扭紧螺旋。
（3）按下“启动”键。（实验室使用全自动灭菌锅按下“启动”键后无需任何操作。具体参数设定：放冷空气温度103℃，灭菌温度121℃，灭菌时间20min。）
（4）灭菌完成，当压力表指针下降至零时，让其自然冷后再慢慢打开放气阀以排除余气，然后才能开盖取物
3、注意事项
①待灭菌的物品放置不宜过紧。
②灭菌完毕后，不可放气减压，否则瓶内液体会剧烈沸腾，冲掉瓶塞而外溢甚至导致容器爆裂。
③须待灭菌器内压力降至与大气压相等后才可开盖
（四）超净工作台
1、超净工作台的构造
超净工作台主要由高效过滤器、紫外灯、荧光灯、电路控制板等构成。
2、超净工作台的使用
（1）插上电源，按下“开关”键。
（2）按下“^∨”键调节风速。
（3）按下“紫外灯”键开启紫外灯，再次按下“紫外灯”键关闭紫外灯。
（4）按下“照明”键开启照明灯，再次按下“照明”键关闭照明灯。
3、注意事项
①使用前开紫外灯15分钟以上照射灭菌，在进入操作之前应先掉紫外线灯，后十多分钟即可入内。
②接种前使用75%酒精抹拭工作台。
③严禁在紫外灯开启状态下进行操作。
二、培养基的制备
1、制备地点——准备室
准备室功能主要包括：实验所需器具洗涤（玻璃器皿经过洗涤后，若内壁的水是均匀分布成一薄层，表示完全洗净。）及灭菌、干燥和放置；培养基的配制、分装和灭菌；试管苗的出瓶及整理；化学试剂的存放及配制；蒸馏水的生产；待培养植物材料的预处理及培养物的常规生理生化分析等操作。
2、培养基母液的配制
为了避免每次配制培养基都要对几十种化学药品进行称量，应该将培养基中的各种成分，按原量的10倍、100倍或1000倍称量，配成浓缩液，这种浓缩液叫做母液。每次配制培养基时，取其总量的1/10、1/10、1/1000，加以稀释，即成培养液。
（1）大量元素母液的配制
各成分按照表1培养基浓度含量扩大20倍用天平称取，用蒸馏水分别溶解，按顺序逐步混合。后用蒸馏水定容到1000ml的容量瓶中，即为10倍的大量元素母液。到入细口瓶，贴好标签保存于冰箱中。配制培养基时，每配1L培养基取此液100ml。
表1MS培养基大量元素母液制备
序号 |
药品名称 |
培养基浓度（mg/L） |
扩大10称量(g) |
1 |
NH4NO3 |
1650 |
33 |
2 |
KNO3 |
1900 |
38 |
3 |
CaCl2·2H2O |
440 |
8.8 |
4 |
MgSO4·7H2O |
370 |
7.4 |
5 |
KH2PO4 |
170 |
3.4 |
注意事项：
①配制大量元素母液时，各种化学药品必须先以少量重蒸馏水使其充分溶解后才能混合，混合时应注意先后顺序。
②特别应将Ca2+、SO42－、Mg2+和H2PO4-等离子错开混合，速度宜慢，边搅拌边混合。
③CaCl2·2H2O要在最后单独加入，在溶解CaCl2·2H2O时，蒸馏水需加热沸腾，除去水中的CO2，以防沉淀。另外，CaCl2·2H2O放入沸水中易沸腾，操作时要防止其溢出。
（2）微量元素母液的配制
MS培养基的微量元素无机盐由7种化合物（除Fe）组成。微量元素用量较少，特别是CuSO4·5H2O、CoCl2·6H2O，因此在配制中分微量Ⅰ、Ⅱ配制。按照表2，表3配方，用电光天平称量，其它同大量元素。配制培养基时，每配制1L培养基，取微量Ⅰ10ml，微量Ⅱ1ml。
表2MS培养基微量Ⅰ的配制
序号 |
化合物名称 |
培养基浓度（mg/L） |
扩大100倍称量(g) |
1 |
MnSO4·4H2O |
22.3 |
2.230 |
2 |
ZnSO4·7H2O |
8.6 |
0.860 |
3 |
H3BO3 |
6.2 |
0.620 |
4 |
KI |
0.83 |
0.083 |
5 |
Na2MoO4·2H2O |
0.25 |
0.025 |
表3MS培养基微量Ⅱ的配制
序号 |
化合物名称 |
培养基浓度（mg/L） |
扩大1000倍称量(g) |
1 |
CuSO4·5H2O |
0.025 |
0.025 |
2 |
CoCl2·6H2O |
0.025 |
0.025 |
注意事项：
①使用电子分析天平时注意不要把药品撒到称盘上，用完以后，用吸耳球将天平内的脏物清理干净。
（3）铁盐母液的配制
铁盐不是都需要单独配成母液，如柠檬酸铁，只需和大量元素一起配成母液即可。目前常用的铁盐是硫酸亚铁和乙二胺四乙酸二钠的螯合物，必须单独配成母液。这种螯合物使用起来方便，又比较稳定，不易发生沉淀。配制方法同上，直接用蒸馏水加热搅拌溶解，定容至1L。配制培养基时，配制1L取此液10ml。
表4 MS铁盐母液的配制
序号 |
化合物名称 |
培养基浓度（mg/L） |
扩大100倍称量(g) |
1 |
Na2-EDTA |
37.3 |
3.730 |
2 |
FeSO4·7H2O |
27.8 |
2.780 |
注意事项：
①配制铁盐母液时，FeSO4和Na2-EDTA应分别加热溶解后混合，并置于加热搅拌器上不断搅拌至溶液呈金黄色(约加热20 - 30 min)，调pH值至5 .5，室温放置冷却后，再冷藏。
（4）有机母液的配制
MS培养基的有机成分有甘氨酸、肌醇、烟酸、盐酸硫胺素和盐酸吡哆素。培养基中的有机成分原则上应分别单独配制。配制直接用蒸馏水溶解，定容至1L，注意称量时用电子分析天平。配制培养基时，每配1L培养基取此液5ml。
表5MS培养基有机物质母液的制备
序号 |
化合物名称 |
培养基浓度（mg/L） |
扩大200倍称量(g) |
1 |
甘氨酸 |
2 |
0.400 |
2 |
肌醇 |
100 |
20.000 |
3 |
盐酸硫胺素(VB1) |
0.5 |
0.100 |
4 |
盐酸吡哆素(VB6) |
0.5 |
0.100 |
5 |
烟酸 |
0.5 |
0.100 |
注意事项：
①配制母液时用无菌重蒸馏水溶解维生素，并贮存在棕色无菌瓶中，或缩短贮藏时间。
（5）激素母液配制
植物组织培养中使用的激素种类及含量需要根据不同的研究目的而定。一般激素母液的配制的终浓度以0.5mg/ml为好，需要注意的是：
(1)配制生长素类，例如IAA、NAA、2，4-D、6-BA，应先用少量95%乙醇或无水乙醇充分溶解，或者用1mol/L的NaOH溶解，然后用蒸馏水定容到一定的浓度。
(2)细胞分裂素，例如KT，应先用少量95%乙醇或无水乙醇加3~4滴1mol/L的盐酸溶解，再用蒸馏水定容。
(3)配制生物素，用稀氨水溶解，然后定容。
注意事项：
①所有的母液都应保存在0~4℃冰箱中，若母液出现沉淀或霉团则不能继续使用。
3、培养基的制作
（1）首先确定培养基的用量。
（2）确定培养基用量，称取所需的琼脂和蔗糖，加蒸馏水（培养基总量的3/4），后加热溶解（若配制液体培养基，则不必加热）。
（3）按照配制培养基需要加入的各种母液用量的比例，分别吸取预先配制好的各种母液备用。
（4）将母液加到煮好的琼脂。蔗糖溶液中，用蒸馏水定容至所需数量，待温度下降到40℃时，调PH值（通常PH值为5.8）。
（5）将培养基分装到盛装容器中并盖上盖子或封口膜。
（6）分装完后立即在121℃条件下进行高压灭菌消毒15~20min。培养基高压蒸汽灭菌的时间取决于灭菌的体积，灭菌时间不宜过长，以免引起培养基成分发生变化。
（7）经过灭菌的培养基最好置于10℃左右条件下保存。（应在消毒后两周内完成。）
三、材料接种
1、材料接种地点——接种室
接种室主要功能包括:进行植物材料的分离、消毒、接种和培养物的启动、继代、转接等。
2、材料接种
（1）操作前准备
包括：准备报纸包好灭菌后的接种工具、酒精灯、75%乙醇、灭菌用脱脂棉以及准备接种工具、培养基、接种用苗和工作台灭菌等。
（2）工作台灭菌
工作台灭菌包括：一是上台前用紫外照射30分钟，二是正式接种前用75%乙醇仔细擦一遍。
（3）无菌操作
①用酒精棉（75%酒精浸泡）将手部（包括手腕）和超净工作台仔细擦拭一遍，再将接种工具灭菌先用酒精擦拭一下。
②待酒精完全干燥后，用打火机点燃酒精灯，将剪刀镊子灼烧消毒。灼烧后的剪刀镊子冷却后开始接种材料。
③打开培养瓶的瓶盖（封口膜），如果不能一次取出其内的全部材料，要先把瓶盖（封口膜）口对着风源放在酒精灯的左前方，然后把瓶口在酒精灯上烤7~10秒；正式取苗时，瓶口不要斜向外；一次取苗不可太多，以免风干。
④镊子最好不要与瓶口接触，一瓶内一般接10苗左右，不要放太多；组培苗在瓶内要排放均匀、整齐、美观。
⑤ 培养瓶口要及时封好，封口膜捆绑其松紧度以用手转不动为准；下台前要把品种代号、培养基类型、个人编号及接种日期表示在瓶上。
⑥离开前要将工作台收拾干净，垃圾清理掉，台上物品也要摆放整齐。
（4）材料放置及实验室整理
操作完成后，及时将材料放于培养室中的培养架上并摆放整齐。将操作台擦拭，整理实验室。
3、后期观察、记录、拍照
观察记录材料相关情况（污染率、成活率、发芽率等），若发现污染材料及时清理出培养室并及时灭菌和处理。拍下每一时期材料的情况。
